酶制劑在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，其具有綠色環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的特性，然而，苛刻的工業(yè)生產(chǎn)條件嚴(yán)重制約著酶在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。針對(duì)天然酶在工業(yè)化應(yīng)用中存在的穩(wěn)定性差和催化活性低等問(wèn)題，借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)改造獲得性能優(yōu)良的酶，是解決該問(wèn)題的常用策略之一。

為了滿(mǎn)足規(guī)模化、集約化的食品工業(yè)發(fā)展需求，研制性能優(yōu)良的食品工業(yè)用酶制劑，對(duì)食品工業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義。酶工程改造中借助計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)可以更高效地獲得突變體，減少試驗(yàn)工作量和縮短試驗(yàn)周期，極大促進(jìn)了人們對(duì)酶結(jié)構(gòu)與功能構(gòu)效關(guān)系的認(rèn)識(shí)。隨著計(jì)算機(jī)硬件和理論方法的發(fā)展，大數(shù)據(jù)及深度學(xué)習(xí)、人工智能的方法也開(kāi)始應(yīng)用在食品工業(yè)用酶改造中。這一數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的技術(shù)為蛋白質(zhì)工程提供了新的開(kāi)發(fā)思路，未來(lái)計(jì)算機(jī)輔助酶設(shè)計(jì)將向著更加智能和高效的方向發(fā)展。

酶是一類(lèi)具有高效催化活性的蛋白質(zhì)，催化活性與其三維結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。高溫、高壓、高滲透壓、極端pH值等食品工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境會(huì)破壞酶的三維結(jié)構(gòu)使其失活，從而極大限制了其在食品工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。針對(duì)此問(wèn)題，對(duì)食品用酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以提升其催化性能，或者從頭設(shè)計(jì)獲得自然界中不存在的酶就變得非常必要。

常用的蛋白質(zhì)改造方法主要有隨機(jī)進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)3種。隨機(jī)進(jìn)化是在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然進(jìn)化，構(gòu)建隨機(jī)突變體文庫(kù)，通過(guò)多輪迭代獲得性狀改善的突變體，然而突變體文庫(kù)受庫(kù)容量及高通量篩選方法限制，有益突變體占比不高。為進(jìn)一步提升定向進(jìn)化的效率，（半）理性設(shè)計(jì)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)基于酶的結(jié)構(gòu)與功能，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)方法發(fā)現(xiàn)潛在突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)小而精的突變文庫(kù)，從而針對(duì)性設(shè)計(jì)和改造蛋白質(zhì)，是目前研究的熱點(diǎn)之一。

食品工業(yè)常用酶制劑分類(lèi)

食品工業(yè)用酶制劑作為一種高效、安全、環(huán)保的生物催化劑以它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在食品工業(yè)中起著重要作用。酶制劑的使用能夠改變食品的形狀和質(zhì)地，增加食品的營(yíng)養(yǎng)功能，改善食品風(fēng)味。食品工業(yè)酶制劑現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于乳制品、食品釀造、肉類(lèi)、焙烤、飲料、果汁和啤酒等食品工業(yè)中。目前食品工業(yè)中常用酶的種類(lèi)超過(guò)55種，主要包括：α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶、普魯蘭酶、葡萄糖異構(gòu)化酶、木瓜蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶等。表1列出了常見(jiàn)的食品工業(yè)用酶制劑及其用途。

表1  常見(jiàn)的食品工業(yè)用酶制劑及其用途

食品工業(yè)用酶設(shè)計(jì)的分子模擬方法

食品工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的極端條件不適合大多數(shù)天然酶充分發(fā)揮其催化性能。除了定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)技術(shù)之外，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)理性設(shè)計(jì)獲得在工業(yè)環(huán)境中性能優(yōu)良的酶也是常用的方法之一。計(jì)算機(jī)模擬輔助酶工程改造通過(guò)分析蛋白序列、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，預(yù)測(cè)突變位點(diǎn)，限定突變范圍，可顯著增加有效突變體的占比，從而大大縮短實(shí)驗(yàn)周期，減少實(shí)驗(yàn)工作量和節(jié)省成本。在食品工業(yè)用酶分子設(shè)計(jì)中常用的計(jì)算工具主要有以下5類(lèi)：同源建模、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、自由能計(jì)算和在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)服務(wù)。

同源建模

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)決定其功能。酶的高效特異催化性能依賴(lài)于其錯(cuò)綜復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。目前蛋白結(jié)構(gòu)解析主要有X射線(xiàn)晶體衍射、核磁共振及冷凍電鏡技術(shù)3種試驗(yàn)方法。上述方法存在各自的局限性：X射線(xiàn)晶體衍射必須獲得優(yōu)質(zhì)的蛋白晶體，然而有些食品用酶不易體外表達(dá)或結(jié)晶；核磁共振不能解析分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)；冷凍電鏡價(jià)格昂貴、普及率較低。與已測(cè)得的龐大數(shù)量的蛋白序列相比，目前解析出的蛋白結(jié)構(gòu)非常少。鑒于此，采用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)預(yù)測(cè)蛋白三維結(jié)構(gòu)就顯得尤為重要，而同源建模是目前應(yīng)用較為廣泛的方法之一。依據(jù)蛋白序列同源性決定結(jié)構(gòu)同源性的原則，可通過(guò)同源性較高且結(jié)構(gòu)已知的蛋白為模板構(gòu)建目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。構(gòu)建流程包括：目標(biāo)序列的搜索、序列比對(duì)、模型構(gòu)建和結(jié)構(gòu)優(yōu)化與評(píng)價(jià)。一般而言，目標(biāo)序列與模板序列的同源性越高，構(gòu)建的模型越準(zhǔn)確。當(dāng)兩者序列同源性小于30%時(shí)，得到的目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性較差，不建議使用該技術(shù)來(lái)構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)。目前同源建模常用的軟件有Modeler和SWISS-MODEL等。

分子對(duì)接

分子對(duì)接是將小分子配基置于蛋白的結(jié)合位點(diǎn)處，基于特定的算法搜尋其合理的取向和構(gòu)象，使得配基與目標(biāo)蛋白的形狀和相互作用都能較好地契合，從而形成互相匹配的結(jié)合模式。根據(jù)分子對(duì)接過(guò)程中是否考慮配基和目標(biāo)蛋白的柔性，可以將分子對(duì)接分為3類(lèi)，即：剛性對(duì)接、半柔性對(duì)接和柔性對(duì)接。剛性對(duì)接是指在對(duì)接過(guò)程中配體和受體都為剛性的，對(duì)接過(guò)程中構(gòu)象不發(fā)生變化。該方法計(jì)算量和計(jì)算難度較小，然而，對(duì)接的準(zhǔn)確性較差。半柔性對(duì)接指在對(duì)接過(guò)程中僅考慮配體的構(gòu)象變化，受體構(gòu)象固定不變，其準(zhǔn)確度和計(jì)算量均適中，因此半柔性分子對(duì)接是目前應(yīng)用較為廣泛的方法。柔性對(duì)接是指在對(duì)接過(guò)程中受體和配體的構(gòu)象均不受限制，可以自由發(fā)生變化。與前兩種方法相比，該方法準(zhǔn)確度更高，然而計(jì)算量也大幅增加，只適用于較小的模擬體系。目前常用的分子對(duì)接軟件為Glide、AutoDock、DOCK和GOLD等。

分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬是基于經(jīng)典力學(xué)和統(tǒng)計(jì)力學(xué)的理論，根據(jù)隨機(jī)給定的初始位置和勢(shì)能函數(shù)計(jì)算出作用在粒子上的力，利用經(jīng)典的牛頓運(yùn)動(dòng)方程，通過(guò)數(shù)值積分得到下一時(shí)刻體系的構(gòu)象，如此反復(fù)，最終獲得體系構(gòu)象隨模擬時(shí)間的變化軌跡。分子力場(chǎng)是經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)，分子力場(chǎng)的參數(shù)是根據(jù)試驗(yàn)測(cè)量值或從頭計(jì)算擬合得到。目前已開(kāi)發(fā)出針對(duì)生物大分子（如蛋白、DNA、RNA及脂質(zhì)）的全原子力場(chǎng)，小分子力場(chǎng)參數(shù)可通過(guò)量化計(jì)算獲得?；贛D模擬計(jì)算除了可以獲得模擬體系動(dòng)態(tài)的結(jié)構(gòu)信息外，還可獲得詳細(xì)的蛋白-蛋白、蛋白-小分子之間的相互作用。MD模擬流程一般包括：結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換、溶劑環(huán)境的構(gòu)建（不同pH值、溶劑及模擬溫度）、能量最小化、平衡模擬、采樣模擬和模擬數(shù)據(jù)分析。目前MD模擬常用的軟件有Amber、Gromacs、CHARMM和NAMD等。

自由能計(jì)算

自由能計(jì)算方法可定量分析蛋白—蛋白、蛋白—小分子之間的結(jié)合作用力。近年來(lái)已發(fā)展出多種自由能計(jì)算方法，包括經(jīng)典的自由能微擾理論、熱力學(xué)積分和分子力學(xué)-泊松玻爾茲曼表面積自由能計(jì)算方法等。自由能微擾和熱力學(xué)積分的計(jì)算結(jié)果雖精確，但需要的計(jì)算資源較多，且計(jì)算時(shí)間長(zhǎng)?；贛D模擬軌跡，利用MM-PBSA自由能計(jì)算方法可以分別獲得分子力學(xué)作用能、極性溶劑化作用能和非極性溶劑化作用能。由于MM-PBSA計(jì)算極性溶劑化作用能時(shí)采用隱式溶劑模型，因此兼顧了計(jì)算精度和效率，被廣泛應(yīng)用于底物-酶相互作用模式研究。

在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)服務(wù)

為了方便初學(xué)者的使用，研究人員開(kāi)發(fā)出用戶(hù)友好操作簡(jiǎn)單的在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)來(lái)提高計(jì)算機(jī)模擬的可及性。突變引起的折疊自由能變化（△△G）與突變體的熱穩(wěn)定性密切相關(guān)，△△G小于0表明突變后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性得到提升，反之則表明突變會(huì)造成蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的喪失。為了提高在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度，目前已開(kāi)發(fā)出3種類(lèi)型的打分函數(shù)（即基于機(jī)器學(xué)習(xí)、基于統(tǒng)計(jì)和基于力場(chǎng)）來(lái)評(píng)估突變對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。常用的在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)包括：I-Mutant、FoldX、PoPMuSiC和ddg_monomer。

B因子（B-factor）是一個(gè)從X射線(xiàn)數(shù)據(jù)中獲得的原子位移參數(shù)，反映因熱運(yùn)動(dòng)而導(dǎo)致的電子密度相對(duì)于其平衡位置的振動(dòng)程度。B因子常用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)單個(gè)殘基的柔性。針對(duì)B因子較大的氨基酸進(jìn)行替換，可降低酶結(jié)構(gòu)柔性，從而提升蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性?；诘鞍仔蛄屑敖Y(jié)構(gòu)的B因子預(yù)測(cè)方法主要有B-FITTER和FIRST。

二硫鍵是蛋白質(zhì)中相鄰兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈巰基脫氫形成的共價(jià)鍵，對(duì)維持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和穩(wěn)定性有重要作用。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，每一個(gè)天然的二硫鍵能為蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)2.3—5.2千卡/摩爾的能量，因此，在合適位置引入二硫鍵可極大地提升蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。常用的在線(xiàn)預(yù)測(cè)軟件有SSBOND、MODIP、DbD2和BridgeD。表2列出了食品工業(yè)用酶設(shè)計(jì)過(guò)程中常用的在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)工具及所需的輸入文件。

表2  食品工業(yè)用酶設(shè)計(jì)的在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)工具

計(jì)算機(jī)模擬方法在食品工業(yè)用酶改造中的應(yīng)用

現(xiàn)代食品工業(yè)中的極端環(huán)境往往會(huì)破壞天然酶的構(gòu)象，使其酶活降低甚至完全失活。為了獲得性能優(yōu)良的工業(yè)酶制劑，可利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)。

提升酶的熱穩(wěn)定性

食品工業(yè)過(guò)程常涉及高溫條件操作，因此對(duì)工業(yè)用酶的耐高溫能力有很高的要求。例如，高溫普魯蘭酶具有降低糖化溶液黏度和強(qiáng)化傳質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，然而，目前大多數(shù)普魯蘭酶是中溫型的，為了提高該酶的耐高溫能力，利用在線(xiàn)計(jì)算工具預(yù)測(cè)正向突變點(diǎn)是目前常用的策略之一。Bi等利用I-Mutant/FoldX在線(xiàn)網(wǎng)絡(luò)工具預(yù)測(cè)酶的單點(diǎn)突變穩(wěn)定性，獲得芽孢桿菌普魯蘭酶突變體G692M。該突變體在70℃時(shí)Tm比野生型升高3.8℃，半衰期延長(zhǎng)2.1倍（見(jiàn)表3）。此外，作者還利用MD模擬解析了該突變體熱穩(wěn)定性提高的分子機(jī)制：降低區(qū)域690—700的RMSF值，增強(qiáng)該區(qū)域的剛性，最終提高了該酶的熱穩(wěn)定性。有時(shí)單點(diǎn)突變的效果不明顯，需要通過(guò)多點(diǎn)突變來(lái)獲得穩(wěn)定性更高的酶。Chen等綜合利用BFITTER/PoPMuSiC計(jì)算工具預(yù)測(cè)潛在突變位點(diǎn)，獲得普魯蘭酶多點(diǎn)突變體E518I-S662R-Q706P，該酶的最適溫度從60℃提高到65℃，60℃下的Tm升高了9.5℃，半衰期延長(zhǎng)11倍。MD模擬分析表明多點(diǎn)突變?cè)黾恿嗣阜肿觾?nèi)的氫鍵、疏水和靜電相互作用。另外，662位的精氨酸取代也可能對(duì)酶熱穩(wěn)定性有所貢獻(xiàn)。前期研究表明，精氨酸出現(xiàn)在嗜熱蛋白表面的頻率較高，這一策略也用于提高淀粉酶和α-L-鼠李糖苷酶的耐熱性能。

單一計(jì)算策略提升酶穩(wěn)定性效果有限，多種計(jì)算策略聯(lián)用可大大提高其計(jì)算效率。Janssen等開(kāi)發(fā)了FRESCO流程，該流程綜合利用計(jì)算機(jī)模擬軟件Rosetta DDG、FoldX和二硫鍵Dynamic Disulfide Discovery算法預(yù)測(cè)潛在突變點(diǎn)，然后利用MD模擬去除結(jié)構(gòu)不合理的突變體，最后通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證突變體的耐高溫能力。目前已利用FRESCO策略獲得了許多耐高溫的酶，包括環(huán)己酮單加氧酶、脂肪酶、植酸酶和羰基還原酶等。

由于脯氨酸具有特殊的吡咯烷結(jié)構(gòu)，比其他殘基具有更少的構(gòu)象自由度，因此脯氨酸取代也是提升酶熱穩(wěn)定性的常用方法之一。針對(duì)脂肪酶熱穩(wěn)定性不高的問(wèn)題，Zhang等通過(guò)試驗(yàn)與計(jì)算機(jī)模擬結(jié)合的方法獲得了耐高溫酶。整個(gè)試驗(yàn)流程如下：（1）同源建模野生型酶的三維結(jié)構(gòu)；（2）野生型酶在不同溫度下的MD模擬，以此確定RMSF值較高的氨基酸殘基位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通常意味著所在區(qū)域構(gòu)象不穩(wěn)定，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行脯氨酸替換可降低主鏈構(gòu)象自由度，增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性；（3）再次利用MD模擬來(lái)篩選熱穩(wěn)定性好的突變體；（4）試驗(yàn)驗(yàn)證突變體的耐高溫性能。利用上述試驗(yàn)方法改造獲得耐高溫的突變體V213P。結(jié)果表明，V213P突變體最適溫度比野生型高5.0℃，半衰期比野生型延長(zhǎng)了70%。

提升酶的酸堿穩(wěn)定性

極端pH值也是影響酶在工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一。常規(guī)α-淀粉酶在低pH值條件下易失活。為了提高其耐酸性，Yang等首先基于枯草芽孢桿菌α-淀粉酶三維結(jié)構(gòu)，選擇位于活性位點(diǎn)空腔內(nèi)的堿性組氨酸His222、His275、His293和His310作為突變點(diǎn)，分別用酸性天冬氨酸替換得到4個(gè)單點(diǎn)突變體，其中H222D突變體失活；進(jìn)一步構(gòu)建兩突變和三突變體，最終獲得耐酸性最好的突變體H275D/H293D/H310D，該突變體在pH4.5時(shí)Kcat/Km提高16.7倍，保溫24h后初始活性保留92%，約為野生型3倍。類(lèi)似的突變策略用于GH11木聚糖酶，基于氨基酸序列比對(duì)的分析結(jié)果，將堿性精氨酸、賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝滨０泛吞K氨酸，得到的兩株突變體比野生型具有更高的耐酸能力，在pH3的環(huán)境下，催化活性分別提高50%和40%。反之，用堿性氨基酸替換酸性氨基酸，可提高酶在堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性。例如：增加木聚糖酶中“絲氨酸/蘇氨酸表面”的精氨酸數(shù)量后，突變體最適pH值比野生型酶最適pH值高。

提升酶的催化活性

利用計(jì)算機(jī)模擬解析酶的催化機(jī)理，進(jìn)而通過(guò)適當(dāng)增加底物與活性位點(diǎn)之間的親和力提高酶的催化性能。Chen等結(jié)合同源建模和分子對(duì)接模擬技術(shù)發(fā)現(xiàn)I-鼠李糖異構(gòu)酶的催化口袋中柔性loop環(huán)對(duì)底物的親和性影響較大。為了提高其催化活性，將位于loop環(huán)上的疏水殘基用極性氨基酸替換獲得V48N/G59N/I63N和V48N/G59N/I63N/F335S突變體，結(jié)果表明：上述兩個(gè)突變體的催化活性均得到大幅提高。最后，利用MD模擬揭示了催化活性提高的分子機(jī)制為兩個(gè)關(guān)鍵殘基突變（V48N和F335S）使得催化口袋收縮，從而增強(qiáng)了酶與底物分子中C6位羥基的相互作用，最終提高了酶對(duì)底物的親和性（見(jiàn)表3）。類(lèi)似的策略也應(yīng)用于高效GH10木聚糖酶的改造。

表3  利用計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)結(jié)構(gòu)改進(jìn)食品工業(yè)用酶性能應(yīng)用實(shí)例

N-糖基化修飾同樣也能提升酶的催化性能。N-糖基化修飾位點(diǎn)的選擇至關(guān)重要。為了選擇合適的修飾位點(diǎn)，Wang等基于β-葡萄糖醛酸苷酶的序列和三維結(jié)構(gòu)分析，選取位于loop/turn區(qū)域且遠(yuǎn)離活性中心的糖基化位點(diǎn)，獲得3個(gè)糖基化的突變體。其中N28位糖基化突變體的Km減小，Kcat/Km增加，表明突變體與底物的親和力增強(qiáng)，催化效率提升。同樣的策略應(yīng)用到β-木糖苷酶、過(guò)氧化物酶中，通過(guò)增加N-糖基化位點(diǎn)均成功提高了酶的催化活性（見(jiàn)表3）。

（路福平  黃愛(ài)嵐  趙蕾  劉曉鳳  郭宵  陳寧  劉夫鋒）